Kronik lenfositik lösemi (CLL), malign bir lenfoma tipidir. Dünya Sağlık Örgütü, CLL’yi öncelikle periferik kan, kemik iliği ve ek olarak lenf nodları, karaciğer ve dalak tutulumu gösteren bir matür B hücre neoplazmı olarak sınıflandırmaktadır [1]. Batı dünyasında yılda 100.000 kişide 2–6 vaka insidansıyla, yetişkinlerde görülen en yaygın lösemi formu [2] ve görece uzun hasta sağ kalımı nedeniyle en yaygın tiptir [3,4].

Baskın olarak monomorfik lenfosit görünümü çoğu kez klonal, neoplastik bir hücre popülasyonunu düşündürür. Tipik CLL’de görüldüğü üzere, anormal lenfositler genellikle düşük mitoz aktivitesi olan küçük, matür görünümlü hücrelerdir [1].

Doğal katil hücreler (NK hücreler) dışında, lenfositlerin soyu bir Pappenheim suşuyla güvenilir şekilde belirlenemez ve yalnızca morfolojik olarak bazı gözlemler yapılabilir. Lenfositlerin güvenilir olarak belirlenmesi için, immün fenotipleme gereklidir. CLL’deki anormal lenfositler; kappa ya da lambda hafif zincirlerinin ekspresyonuyla CD19, CD20, CD5, CD23, CD43 ve CD200 yüzey antijenlerini eksprese eder [5]. CD10, negatif bulunur.

Vaka Arka Planı

Bir hasta, rahatsızlık hissi şikâyetiyle aile hekimine başvurmuştur. Periferik kan örneği alınarak laboratuvara gönderilmiştir. XN-20 ile yapılan ilk analizde, normal PLT sayımı gösterilmiş ve anemi bulgusuna rastlanmamış, ancak malign olma potansiyeli olan hücrelerin varlığıyla lenfositoz ortaya çıkarılmıştır. Klinisyen, örneği immün fenotipleme yoluyla analiz için akış sitometrisi laboratuvarına göndermiştir. Örnek, XF-1600 analizöründe ölçülmüş ve CD19, CD5, CD20, CD23, CD79b bakımından pozitif bulunmuş ve lambda hafif zinciri monoklonal proliferasyonu tespit edilmiştir.

Ayrıca, bir kan simiri yapılmış ve DI-60 otomatik dijital görüntüleme analizörü kullanılarak analiz edilmiştir. Simir incelemesinde, yüksek çekirdek-sitoplazma oranı ve yoğunlaşmış kromatin çekirdek paterni olan küçük lenfositler olduğu görülmüştür. Kronik lenfositik lösemi hastalarında tipik olarak görülen leke hücreleri de görülmüştür [6].

Saçılım grafiği ve morfolojinin yorumlanması

Hastanın kan analizinde, 26,17 x10³/µl gibi belirgin biçimde artmış bir WBC sayımı tespit edilmiş olup bu sayımın %80’i lenfositlerden oluşmuştur (Lymph# 21,15 x10³/µl). Bu durum, lenfosit popülasyonunun oldukça yoğun bir bulanıklık sergilediği WDF saçılım grafiğinde görülebilir.

WPC kanalında kullanılan reaktifler, WBC membranları üzerinde WDF kanalında kullanılanlardan çok daha güçlü bir lizis etkisine sahiptir ve bu da daha yüksek hücre geçirgenliğine yol açar. WPC kanalında kullanılan spesifik floresan belirteç, hücrenin çekirdeği içindeki DNA’yı etiketler. Geçirgenlik derecesi ne kadar yüksek olursa, floresan belirteç, hücreye o kadar çok girer ve DNA’ya bağlanarak yüksek floresans sinyaline neden olur. Daha matür olan neoplastik lenfositler, hücre membranlarının daha yüksek lipid içeriğinden dolayı zaten geçirgenleşmiş membranlara sahiptir ve dolayısıyla yüksek bir floresans sinyali yayarlar. Bu durum, Şekil 1’deki WPC saçılım grafiğinde görülebilir: Neoplastik lenfositler, WPC saçılım grafiğinin yüksek floresan alanında bir kırmızı nokta kümesi oluşturmaktadır. WPC saçılım grafiğinin SSC-FSC görünümü iki farklı lenfosit popülasyonu göstermektedir (mavi daireler).

Şekil 1 XN IPU “Lab. Only” (Sadece Laboratuvar) ekranında, diferansiyel sayımı ve WDF, WNR ve WPC saçılım grafikleri gösterilir.

DI-60 otomatik dijital görüntüleme analizörü kullanılarak yapılan morfolojik analizde, leke hücrelerinin varlığı ortaya konulmuştur.

Şekil 2 Leke hücrelerinin ortaya çıkarıldığı dijital görüntüleme (DI-60 analizörüyle).

İmmün fenotipleme sonuçlarının yorumlanması

Nihai sonuçları etkileyebilecek, plazmada harici immünoglobulin olasılığını ortadan kaldırmak için örnek, boyama öncesinde yıkanmıştır. Bundan sonra, bir lizis/yıkama protokolü gerçekleştirilmiştir. Kısaca:

Bir antikor karışımı 75 mm x 12 mm polistiren tüp içine yerleştirilmiştir
100 μl yıkanmış örnek, aynı tüpün içine alikotlanmış ve 5 saniye süreyle 2500 rpm devirde vorteksle karıştırılmıştır
Oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika inkübasyona bırakılmıştır
Eritrositleri çözündürmek ve lökositleri fikse etmek amacıyla, 1:10 oranında seyreltilmiş CyLyse FX’in 2 ml’si tüpe yerleştirilmiş, 5 saniye süreyle 2500 rpm devirde vorteksle karıştırılmıştır
Oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübasyona bırakılmıştır
Bunun ardından, örnek, PBS ile iki kez yıkanmış ve analiz için XF-1600’e yerleştirilmiştir

Monoklonal antikorların, hücre yüzeyindeki spesifik hedef antijene tutunması için antikor/antijen etkileşimleri, örnek ve antikor karışımı içerisinde gerçekleşir. Her monoklonal antikor, akış sitometresinin tespit ettiği bir floresan işaret etiketine sahiptir ve bu sayede kullanıcı neyin pozitif ve negatif olduğunu ayırt edebilir ve dolayısıyla bir tanı konulmasına olanak sağlanır.

CyLyse FX; antikor ve etiket tutunmuş haldeyken eritrositleri çözündüren ve lökositleri fikse eden, formaldehit bazlı bir lizis solüsyonudur. Lizis olmadığında, akış sitometresi, bu test için gerekli olmayan eritrositleri de elde edecektir.

Son olarak, eritrosit debrisinin elde edilmesi olasılığını ortadan kaldırmak için örnek yıkanır ve bu da kullanıcının örneğin elde edilmesi sırasında daha net bir görüntü elde etmesine olanak sağlar ve doğru veri analizini mümkün kılar.

Bu vakada, immün fenotiplemede lenfositoz ve mat bir CD19/CD5 ikili pozitif popülasyon gösterilmiştir. Ek olarak, lambda hafif zincirinin monoklonal proliferasyonu da gözlemlenmiştir. Örnek ayrıca CD20, CD23 ve CD79b eksprese etmiş ve CD10, CD11c ve CD38 bakımından negatif bulunmuştur; tüm bunlar B-CLL tanısını işaret etmektedir.

Şekil 3 XF-1600’dan alınan ve lambda immünoglobulinleriyle B hücrelerinin (mor) anormal monoklonal proliferasyonunu gösteren lambda, CD19, CD5, CD20 ve CD23 saçılım grafikleri.

Referanslar

[1] WHO (2017): Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition, Volume 2

[2] Rozman C et al. (1995): Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 333(16): 1052-1057.

[3] Lanasa MC et al. (2010): Novel insights into the biology of CLL. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2010:70-6.

[4] NIH National Cancer Institute (1975-2007): SEER Cancer Statistics Review.

[5] Rawstron AC et al. (2017): Reproducible diagnosis of chronic lymphocytic leukemia by flow cytometry: An European Research Initiative on CLL (ERIC) & European Society for Clinical Cell Analysis (ESCCA) Harmonisation project. Cytometry B Clin Cytom. 94(1): 121-128.

[6] Marionneaux SM et al. (2021): Smudge Cells in Chronic Lymphocytic Leukemia: Pathophysiology, Laboratory Considerations, and Clinical Significance. Lab Med. 52(5): 426-438.

White paper

Going beyond the visible: Reliable characterisation of WBC functionality

The white blood cell differential (WDF) channel utilises fluorescence markers that can separate different WBC subtypes according to their cell membrane composition and cytoplasmic content

Download

Bilimsel Takvim 2023

Aylık vakalarımızı keşfedin